血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻大鼠Smad信号通路分子的影响.pdf 4页VIP

LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2008VOL．19NO．11 时珍国医国药2008年第 19卷第 11期 血府逐瘀胶囊 对单侧输尿管梗阻大鼠Smad信号通路分子的影响 陆 敏 ，周 娟 ，陆海英 ，王 飞 ，刘煜敏 ，张 悦 (1．上海中医药大学科技实验中心，上海 201203； 2．上海中医药大学医学护理学院，上海 201203) 捅要 ：目的 探讨血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻(unilateralureteralobstruction，UUO)所致大鼠肾间质纤维化的作用及 机理。方法 雄性sD大鼠34只随机分为4组：正常组(6只)、假手术组(6只)、模型组(11只)、血府逐瘀胶囊治疗组(11 只)，采用UUO法建立大鼠肾间质纤维化模型，造模次 日予以血府逐瘀胶囊灌 胃治疗，3周后检测血清肌酐和尿素氮含 量，观察肾功能变化；取 肾组织进行HE和_，2-、胺银染色(periodicacid—silvermetheramine，PASM)，观察肾组织病理变化； 采用Westernblotting分别检测肾组织中磷酸化Smad2(phospho—Smad2，P—Smad2)，Smad2，Smad4，Smad7蛋白表达水平， 观察 Smad信号通路分子表达水平的变化。结果 与正常组和假手术组比较，模型组大鼠血肌酐和尿素氮含量显著上升： 肾小管基底膜明显增厚，部分肾小管上皮细胞变性，肾小管扩张与萎缩并存，肾间质明显增宽，纤维组织增生。大量炎细 胞浸润；P—Smad2和Smad2蛋白表达显著上调 ，Smad7蛋白表达显著下调(P0．01)，而Smad4蛋白表达水平无明显差 异。各项指标正常组与假手术组均无差异。血府逐瘀胶囊治疗后，大鼠血肌酐和尿素氮含量显著降低 (P0．05)，梗阻 侧肾组织病理改变明显轻于模型组，P—Smad2和Smad2蛋白表达明显减少(P0．05)，而Smad7表达没有明显改变。结 论 血府逐淤胶囊可通过抑制梗 阻侧 肾组织中Smad2蛋白的表达以及活化，减少Smad通路信号传导，从而改善梗阻}生肾 病模型大鼠的肾功能和肾间质纤维化程度。 关键词 ：血府逐瘀胶囊； 肾间质纤维化； Smad通路信号分子 中图分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：1008-0805(2008)l1-2691-03 Effectsof “XueFuZhuYnCapsule”onExpressionofSmadSignalPathwayM oleeIllesin RatswithUUo LUMin ，ZHOUJuan ，LUHai．ying ，WANGFei，LIUYu—rain ，ZHANGYue” (1．ScientificExperimentalCenterofShanghaiUnive~ity ，Shanghai201203，China；2．Nursing Schoof，Shanghai e ofTCM，Shanghai20l203，China) Abstract：0bjectiveTostudytheeffectandmechanismsof“XueFuZhuYuCapsule”onrenalinterstitialfibrosisinducedby unilateralureteral obsturctioninrats．MethodsThirty—fourmalesprague—dawleyratswererandomlydividedintofourgroups： thenormalgroup(n=6)，thesham—operatedgroup(-／t：6)，themodelgroup(n=11)andthe“XueFuZhuYuCapsule”trea— tedgroup(n=I1)．Modelofrenalinterstitialfibrosisiwasestablishedinratsbyunilateralureteralobsturction．andtheratsinthe treatmentgroupweretreatedwith “XueFuZhuYuCapsule”onthenextdayafteroperation．Theserum creatinine(SCr)and bloodureanitrogen(BUN)leverlsinanimalsofallgroupswereassayedattheendofthe3thweekaftertreatment．Theobstructed renal tissuewasstainedwithHE nadPASM．respectively．Protein expressionlevelsofphospho—Smad2，Smad2．Smad4 and Smad7intheobsturctedkidneywereanalyzedbyWesternblotting．ResultsThelevelsofSCrnadBUN inanimalsofthemodel groupwerehigherthna thoseinthenormalgroupandthesham —operatedrgoup．Pathological examinationofthekidneysinthe modelgroupshowedthetubularbasementmembranethickened，apartoftubularepithelialcelldegenerated，apartofrenaltubule expandednadapartofthem atrophied，tubulra interstitium broadened，fibroustissueproliferatedandlrageamountofinflma mato． rycellinfihrated．Theexpressionlevelsofphospho—Smad2nadSmad2proteininobstructedrenaltissueweresignificantlyup— regulatedandSmad7proteinweresingificantlydown—regulated(P0．01)，whilethatofSmad4proteinwasnotdifferent．A1li- temswerenotdifferentinratsofthenomr algroupandthesham —operatedgroup．Incomparisonwiththemodelrgoup，“XueFu ZhuYuCapsule”decreasedSCrandBUNlevels(P0．05)，maelioratedthepathologicallesionoftheobstructedkidney，down — regulatedtheexpressionlevelsofphospho—Smad2andSmad2protein(P0．05)，buttheexpressionlevelsofSmad7didnt chnaged．Conclusion “XueFuZhuYuCapsule”callinhibittheexpressionandactivationofSmad2protein，reducethesignal trnasductionofSmadpathway。therebyblocktheprorgessionofrenal interstitial fibrosiscausedbyUUO inrats． KeYwords： “XueFuZhuYuCapsule”： Tubulointerstitialfibrosis； Smadpathwaysignalmolecules 肾间质纤维化是各种原因所致的肾脏疾病发展至后期的共 同表现 ，是导致终末期肾功能衰竭的主要原因之一。积极防治肾 间质纤维化，对慢性肾脏疾病的转归具有重要意义。近年来的临 收稿 日期：2008-05—19； 修订 日期：2008-09—10 床资料显示 ，血府逐瘀汤具有改善肾功能、防治肾纤维化发生、延 基金项 目：国家 自然科学基金 (No； 上海市教育委员会科研项 目(No．06ez015)； 缓肾功能衰竭的作用…，但其作用机制尚不明确。本实验应用 上海市教育委 员会重点学科建设资助项 目(No．J50301)； 血府逐瘀胶囊对单侧输尿管梗阻(UUO)所致肾间质纤维化大鼠 作者简介：陆 敏 (1974一)，女(汉族)，江苏启东人，现任上海中医药大学 进行干预 ，观察其疗效及作用机制，为血府逐瘀胶囊防治肾间质 科技实验中心助理研究员，硕士学位，主要从事中西医结合防治肾纤维化 纤维化的临床应用提供理论依据。 的基础研 究工作． ’通讯作者简介：张 悦 (1956一)，女(汉族)，山东潍坊人，现任上海中医 1 材料与仪器 药大学科技实验中心教授，博士学位，主要从事中西医结合防治肾脏疾病 1．1 动物 雄性SD大鼠34只，SPF级，体重 160～180g，由中国 的基础研 究工作． · 269l · 时珍国医国药2008年第 19卷第 11期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2008VOL．19NO．11 科学院上海实验动物中心提供 ，合格证号：SCXK(沪)2002 性福尔马林缓冲液固定，经常规脱水、包埋、切片后分别进行 HE — 0002。 和PASM染色。 1．2 药物 血府逐瘀胶囊 ，购自天津宏仁堂药业有限公司，主要 2．5 肾组织中Smad通路信号分子蛋白表达分析 采用Western 成分为桃仁、红花、当归、川芎、地黄、赤芍、牛膝、柴胡、枳壳、桔 blot法。取 100mg左右肾组织置于 1mlRIPA匀浆缓冲液中匀 梗 、甘草，用时将胶囊内药粉用蒸馏水配制成 0．24g／ml的7昆 浆 ，离心(12000#min，10min，4℃)，留取上清，BCA蛋白检测试 悬液 。 剂盒测定裂解液蛋白浓度。按 比例加入适量6×SDS上样缓冲 1．3 试剂 血清肌酐检测试剂盒、血清尿素氮检测试剂盒 (南京 液 ，100℃变性 5min，取 30 g的组织蛋 白样本经 10％ SDS一聚 建成生物工程研究所)，BCA蛋白浓度测定试剂盒 (美国Pierce 丙烯酰胺凝胶电泳分离，再转移至 PVDF膜上 (PierceChemical 公司)，兔抗大鼠磷酸化 Smad2多克隆抗体 (美国Chemicon公 Company，USA，简称标本膜)。用含5％脱脂奶粉的TBST室温 司)，小鼠抗大鼠Smad2单克隆抗体 (美国CellSignaling公司)， 封闭标本膜 1h，然后分别加入兔抗 P—Smad2抗体 (1：500)、小 小鼠抗大鼠Smad4单克隆抗体(美国SantaCruz公司)，小鼠抗大 鼠抗 Smad2抗体 (1：1000)、小鼠抗 Smad4抗体 (1：200)、小鼠 鼠Smad7单克隆抗体 (美国RD公司)，辣根过氧化物酶耦联的 抗Smad7抗体 (1：500)，4cc孵育过夜，洗膜 ，再与相应的辣根过 小鼠抗兔GAPDH单克隆抗体 (上海康成化学生物技术公司)，辣 氧化物酶耦联的第2抗体室温作用 1h，充分洗涤后 ，用 ECL试 根过氧化物酶耦联的第2抗体 (晶美生物工程有限公司)，ECL 剂检测标本膜上的信号，X一片记录实验结果。以计算机成像和 化学发光试剂盒(美国PiercePierce公司)。 图像分析仪 ，测定x一片上杂交条带的光密度值，代表蛋白的表 1．4 仪器 纯水系统 (美国Labconco)，低温离心机(德国Eppen— 达量。同一张标本膜曝光后以0．5％十二烷基硫酸钠洗脱抗体， doff公司)，聚丙烯酰胺凝胶电泳仪及电转移仪 (美国Bio—Rad 再与GAPDH抗体 (1：5000)孵育杂交，作为内参照。每个实验 公司)，凝胶成像和图像分析仪 (上海复 日公司)。Centrifuge 重复 3批 以上不同样本。 5417R低温高速离心机 (德国Eppendorf公司)。LeieaRM213切 2．6 统计学方法 采用 SPSS10．0统计软件包进行 ANOVA单 片机以及LeicaEG119自动包埋机(德国莱卡公司)。 因素方差分析。 2 方法 3 结 果 2．1 单侧输尿管梗阻动物模型的建立 大鼠腹腔注射3％戊巴 3．1 大鼠体重增长、肾脏重量变化比较 见表 1。造模后大鼠体 比妥钠 (2ml／kg)麻醉，呈左侧卧位固定于手术板上，常规消毒， 重增加明显低于正常组与假手术组 (P0．01)，治疗组体重增加 打开腹腔、腹膜，暴露并分离左侧输尿管，4～0缝合线在左输尿 高于模型组 ，但差异无统计学意义。留取左侧肾脏时发现，模型 管上 1／3处两次结扎，止血，抗感染，3—0缝合线连续缝合关闭 组与治疗组大鼠左侧。肾脏较右侧明显增大，颜色变浅，有尿液潴 腹腔，间断缝合皮肤。假手术组不结扎输尿管，其余操作过程均 留，肾皮质变薄，肾盂扩张。模型组与治疗组左肾肾体比及左右 相同。正常组不做任何处理。 肾重比均显著高于正常组与假手术组 (P0．01)，模型组与治疗 2．2 分组与给药 大鼠被随机分为正常组(n=6)、假手术组(n 组无明显差异。正常组与假手术组体重增长、左肾。肾体比以及左 = 6)、模型组 (=I1)以及血府逐瘀胶囊治疗组 (n：11)。治疗 右肾重比均无明显差异。 组于术后第2天以2．4g／(kg·d)血府逐瘀药液灌胃，假手术组 3．2 各组大鼠血清肌酐与尿素氮含量比较 见表 1。模型组、治 及模型组均以等量生理盐水灌胃，正常组正常饲养。实验期间动 疗组血肌酐含量显著高于正常组和假手术组，以模型组为重 ，两 物 自由进食饮水。治疗21d后杀检，取材备用。 组比较有统计学差异 (P0．05或P0．01)。模型组尿素氮含 2．3 血清肾功能测定 分别采用苦昧酸法和二乙酰一肟法测定 量显著高于正常组、假手术组与治疗组 (P0．05)，治疗组与正 大鼠血清肌酐以及尿素氮含量，严格按试剂盒说明书进行操作。 常组、假手术组比较差异无统计学差异。正常组与假手术组比较 2．4 肾组织病理染色 取左侧肾脏 1／4大小组织块，以10％中 无明显差异。 表 1 各组大鼠体重增长、肾脏重量以及血肌酐、尿素氮测定结果比较(±s) 与模型组比较，P0．05，一P0．0l；左肾肾体比为左肾重量 ×2与体重之比：n=6 3．3 各组大鼠肾组织病理检查结果比较 见图1。梗阻侧肾组 3．4 各组大 鼠肾组织中Smad通路信号：flY-蛋 白表达 比较 织HE染色和PASM染色可见模型组大鼠肾小管扩张，部分肾小 Wseternblot显示，模型组肾组织 中P—Smad2与 Smad2蛋白表 管萎缩 ，肾小管上皮细胞浊肿，部分坏死与脱落 ，肾小管基底膜明 达均显著高于正常组与假手术组 (图2，表 2)，Smad7蛋白表达 显增厚 ；肾间质明显增宽，成纤维细胞增多，炎性细胞浸润，纤维 显著低于正常组与假手术组(P0．01)(图3)。中药血府逐瘀 组织增生；皮质中肾小球数量明显减少，肾小球形态基本正常。胶囊能明显抑制 P—Smad2与Smad2蛋白表达 ，与模型组比较 血府逐瘀胶囊治疗组大鼠皮质中肾小球数量明显多于模型组，肾 差异有统计学意义(P0．05)，但对 Smad7蛋白表达没有明显 问质略有增宽，扩张与萎缩的。肾小管数量少于模型组，肾小管基 影响。Smad4蛋 白表达各组问比较差异无统计学意义 (图4)。 底膜轻度增厚，肾小管上皮细胞以变性为主，少见坏死，病变明显 P—Smad2，Smad2，Smad7蛋白表达 ，正常组与假手术组无明显 轻于模型组 (图1)。 差异。 · 2692． LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2008VOL．19NO．11 时珍国医国药2008年第 19卷第 11期 4 讨论 单侧输尿管结扎(UUO)模型是 目前国际公认的肾小管间质 一嘲露 纤维化模型。该模型 由于尿液排出受阻，肾盂及肾小管压力增 高，导致肾盂等集合管系统扩张，肾间质水肿，局灶性炎症细胞浸 润，最终造成肾间质纤维化及肾萎缩。本实验采用经改 良的大鼠 肾问质纤维化模型 ，观察到 UUO模型大鼠左肾肾体比、血肌 ■_ 豳 酐、尿素氮含量较正常组和假手术组显著增高，梗阻侧肾组织病 理染色显示肾小管扩张萎缩并存、肾小管基底膜增厚，肾间质增 1．假手术组(HE染色，200x) 2．模型组(HE染色，200x) 3．治疗组(HE染色，200×) 4．假手术组(PASM染色，200×) 宽、间质炎细胞浸润、纤维组织增生，证实单侧输尿管梗阻诱导的 5．模型组 (PASM染色，200×) 6．治疗组 (PASM染色，200×) 大鼠肾问质纤维化模型已制备成功，与文献报道一致 I4]。 图1 各组大鼠肾组织病理形态观察 。肾间质纤维化是肾脏受到各种致病因素作用后 ，慢性损伤与 修复反应反复进行的结果。根据中医“病久入络”“久病在血”的 理论，肾问质纤维化的中医病机可概括为气滞血淤，淤血内停 ，阻 滞于肾络。血府逐瘀汤由桃红四物汤合四逆散加桔梗、牛膝而 l 成。全方行气活血，化淤止痛，专为 “胸 中血府血淤”而设 ，故临 床以血府逐瘀汤加减 ，采用活血化瘀法治疗肾纤维化，取得了满 意的疗效 。本实验应用血府逐瘀胶囊对 UUO大 鼠灌 胃治疗 21d后 ，观察到治疗组大鼠血肌酐、尿素氮含量较模型组显著降 低，组织病理染色显示其病理改变也明显轻于模型组，说明血府 逐瘀胶囊对梗阻性肾病的肾功能及肾间质纤维化具有明显的改 图2 各组大鼠肾组织中p—Smad2与Smad2蛋白表达比较 善作用。 表2 各组大鼠肾组织中p—Smad2与Smad2蛋白表达比较(±s) ％ ：一常 鞭于 近 陵型 尊胡 —舅 —● 势 _尊 _。 与模型组比较，P0．05，一P0．O1；n：3 OO 肾问质纤维化的发生 、发展是一个多途径、多环节的作用过 舌 80 程，涉及多种细胞因子的表达调控，其中转化生长因子 一B1 鼍 I、 6O (transforminggrowthfactorpl，TGF一8】)是国际公认的最重要的 40 促纤维化因子之一。大量研究证实，Smad蛋白是TGF一311信号 从受体到核的细胞内转导分子。Smad蛋白根据其结构和功能不 同可分为 3类 ：第 1类为受体调控型 Smads，包括 Smad2和 正常组 艘手术组 模 型组 Smad3；第2类为Co—Smad，即Smad4；第3类为抑制型Smads，即 模型组 比较，“P0．0l Smad6和Smad7。Smad2和Smad3能直接被跨膜的TGF—B。第 1 图3 各组大鼠Smad7蛋白表达 类型受体激酶磷酸化，活化的Smad2／Smad3与 Smad4形成复合 物转移至核内，激活TGF—B。靶基因的表达，加速肾纤维化的进 展 J。Smad6和Smad7是 Smad信号通路 中的逆向调控因子，它 们可通过与磷酸化的Smad2／3结合或与活化的受体结合 ，直接或 问接地减少 Smad2／3的活化 ，从而阻断Smad通路信号传导，抑 制肾间质纤维化的进展”。本实验中Westernblot结果显示 ， UUO模型大鼠肾组织中P—Smad2，Smad2蛋白表达较正常组和 假手术组显著上调，Smad7蛋白表达显著下调，表明存在Smad信 号通路分子的活化。血府逐瘀胶囊可明显降低增高的P—Smad2 和Smad2蛋白表达水平，但对 Smad7蛋白表达影响不大，说明血 府逐瘀胶囊能明显抑制 Smad2蛋 白的表达和活化，从而减少 Smad通路信号传导，但这种作用不是通过上调 Smad7蛋 白表达 实现的。本实验中Smad4蛋白表达水平虽然无明显变化，但可能 正常组 假手术组 模 型组 治疗组 存在其它因子例如Smad转录共抑制因子 SnoN／Ski与P—Smad2 图4 各组大鼠Smad4蛋白表达 竞争结合Smad4，减少活化的Smad2与Smad4异源复合物的形成 · 2693 · 时珍国医国药2008年第 19卷第 11期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2008VOL．19NO．11 的情况_8J。这有待于今后的实验加以证实。 [4] 刘煜敏，张 悦，何立群 ，等．抗纤灵抗大鼠肾间质纤维化的实验研 上述实验提示，血府逐瘀胶囊抑制Smad2蛋 白的表达与活 究[J]．中国中西医结合杂志，2007，27(10)：901． 化，减少TGF—B，依赖的Smad信号通路的激活，可能是其抗肾 [5] 张史昭，潘达亮，于 伟，等．肾络瘀阻与肾纤维化关系的临床研究 [J]．中国中西医结合肾病杂志，2003，4(8)：458． 间质纤维化的重要作用机制之一。 [6] ShiYG，MassagueJ．MechanismsofTGF一31SignalingfromCellMem— 参考文献： branetotheNucleus[J]．Cell，2003，113(6)：685． [7] HuangY，Bo~erWA，NobleNA．PerspectivesonblockadeofTGF～ [1] 张史昭，潘达亮，于 伟，等．肾络瘀阻与’肾纤维化关系的l}缶床研究 overexpression[J]．KidneyInt，2006，69(10)：17l3． [J]．中国中西医结合。肾病杂志，2003，4(8)：458． [8] UekiN，HaymanMJ．DirectinteractionofSkiwitheitherSmad3or [2] 刘克剑，张 悦，李 靖，等．单侧输尿管梗阻法制作大鼠肾间质纤 Smad4 isnecessaryandsufficientforSki——mediatedrepressionoftrans-· 维化模型的改进[J]．中国实验动物学报，2007，15(6)：410． forminggrowthfactor—betasignaling[Jj．JBiolChem，2003，278 [3] 孙广东，李 才，李相军，等．阿魏酸钠对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏 (35)：32489． 损害的改善作用 [J]．中国老年学杂志，2007，27(1)：5． 川楝子致小鼠肝毒性时效、量效关系研究 齐双岩 ，熊彦红 ，金若敏 (1．上海中医药大学药物安全评价研究中心，上海 201203；2．上海 中医药大学中药学院，上海 201203) 摘要：目的研究川楝子致小鼠肝毒性的时效、量效关系。方法 小鼠灌服不同剂量川楝子，测定其LD。。另取小鼠按不 同时间点或不同剂量分组，检查血清A ，AST，计算肝、脾、胸腺脏器指数，并观察肝组织形态变化。结果 小鼠灌服川楝 子的LD 为200g·kg～。ALT，AST在给药后 1h达到高峰，24h可恢复近正常值。与正常组比较，川楝子81，166g／kg 剂量组对肝组织产生明显损伤，且随着剂量增大，ALT，AST升高显著(P0．05或P0．01)。结论 小鼠单次灌服一定 剂量川楝子可造成急性肝损伤甚至死亡，并显示有毒性时效、量效关系。 关键词：川楝子；小鼠；肝毒陛 中图分类号：R285．5 文献标识码 ：A 文章编号：1008-0805(2008)l1-2694-03 Time —dose —effectStudiesonHepatotoxicitvOfM iceInducedbVFructus osendan QIShuang—yan ，X10NGYan-hong‘，JINRuo—min ’ (1．ResearchCenterofAnimalSafetyEvaluation，ShanghaiUniversityof ，Shanghai201203，China；2． SchoofofChineseMateriaMedica，ShanghaiUniversityof ，Shanghai201203，China) Abstract：0bjeetiveTostudythetime—effectrelationanddose—effectrelationofhepatotoxicityinducedbyFructusToosendan inmice．MethodsThemediallethaldose(LDn)ofmicewascalculatedafterdifierentdosesofFruct~Toosendanwasgivenoral— ly．Thenthemiceweredividedintodifferentgroupsaccordingtodifierentdosesortime．andthecontentsofsernm alanineamin— otransferase(A )，aspartateaminotransferase(AST)wereinvestigated，thethymus，liverandspleenwerewelg‘hed，andthe livertissuewasstudiedwithhistopathologicaltoobservethedegreesofinflammatoryactivityandfibroushype~lasia．ResultsThe LD5oofFructusToosendanwas200g／kg，95％ confidencelevelofwhichwas192～212 kg，ALT，ASTinserum reacheditspeak after1hour，whichrecoveredcloselytonolxnalvalueafter24hours．Comparedwithcontrolgroup．hepatictissuesofthehighand mediumdosergoupsweredamagedsignificantly，andthecontentsofAIJrrandASTinserumwereincreasedsignificantly (P 0．05orP0．01)．Conclusion